Nghiên cứu mới nhất của Nhật về rong Nâu Việt Nam

Đọc Full Màn hình
×

INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES 49 (2011) 331-336

 

Fucoidan chiết xuất từ Sargassum sp. và fucus vesiculosus làm giảm khả năng tồn tại của các tế bào ung thư phổi và các tế bào ung thư hắc tố da ác tính trong ống nghiệm và kích hoạt các tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) trên cơ thể của chuột thực nghiệm


Marcel Tutor Ale (a), Hiroko Maruyama (b), Hidekazu Tamauchi (c), Jorn D. Mikkelsen (a), Anne S. Meyer (a),
(a) Trung tâm Xử Lý Sinh Học, Hóa chất và Kỹ thuật Hóa sinh, Đại học Kỹ thuật Đan Mạch (DTU), tòa nhà Soltofts Plads 229, 2800 Kgs. Lyngby, Đan Mạch
(b) Chuyên ngành Bệnh học, Khoa liên kết Khoa học, Đại học Kitasato, Kitasato 1-15-1, Sagamihara, Kanagawa 228-8555, Nhật Bản
(c) Chuyên ngành Vi sinh vật, Khoa Y, Đại học Kitasato, Kitasato 1-15-1, Sagamihara, Kanagawa 228-8555, Nhật Bản
Ngày 06 tháng 3 năm 2011. Sửa đổi 21 tháng Tư 2011. Chấp nhận 14 May 2011. Có sẵn trực tuyến ngày 23 tháng 5 năm 2011.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2011.05.009
-------------------------------------------------- ------------------------------

Tóm tắt

Fucoidan được biết đến với các hoạt động sinh học rất quan trọng, bao gồm cả hoạt động chống khối u. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra ảnh hưởng của fucoidan thô được chiết xuất từ Sargassum sp. (MTA) và fucus vesiculosus (SIG) trên các tế bào ung thư phổi Lewis (LCC) và các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 (MC). Trong vitro, các nghiên cứu được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích khả năng tồn tại của tế bào và cho thấy fucoidan SIG và MTA làm giảm đáng kể số lượng của các tế bào LCC và MC phát triển ở liều đáp ứng. Sự nhuộm các chất hóa học cho thấy được những sự thay đổi hình thái của các tế bào u hắc tố da B16 sau khi tiếp xúc với fucoidan. Những thay đổi quan sát được thể hiện fucoidan thô gây ra quá trình apoptosis. Chuột đực C57BL/6JJCL đã bị tiêm màng bụng hàng ngày, hơn 4 ngày với một trong hai loại fucoidan SIG hoặc MTA (liều 50 mg / kg trọng lượng cơ thể). Mức độ hoạt hóa các tế bào diệt tự nhiên (NK) được tăng cường bởi fucoidan thô một cách phụ thuộc vào liều dùng theo sự hiển thị bởi chất đồng vị phóng xạ [51Cr ] được đánh dấu lên tế bào đích lympho chuột YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK) giải phóng ra.

Nghiên cứu này cung cấp sự thể hiện rõ rằng fucoidan thô tác động hiệu ứng hoạt tính sinh học vào mô hình tế bào ung thư phổi và da trong ống nghiệm và gây ra sự tăng cường kích hoạt các tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) trên cơ thể chuột thí nghiệm.

1. Giới thiệu
Fucoidan là một thuật ngữ được sử dụng cho một nhóm polysaccharides giàu sulfate fucose có chứa một lượng khác nhau của galactose, xylose và acid glucuronic. Fucoidan có thể được chiết xuất từ rong biển màu nâu như Sargassum sp. và fucus sp. Gần đây, chức năng sinh học đa dạng của fucoidan đã được nghiên cứu chuyên sâu, các chức năng sinh học thường được cho của fucoidan bao gồm kháng u và điều hòa miễn dịch [1] và [2], chống virus [3], tác dụng chống huyết khối và chống đông máu [4]. Việc sử dụng các hợp chất tự nhiên hoạt tính sinh học cho ngăn chặn, phòng ngừa ung thư phát triển mạnh và đã được công nhận là một lĩnh vực tiềm năng rất lớn [5]. Fucoidan chiết xuất từ rong biển màu nâu đã được báo cáo để tăng cường hoạt động của tế bào miễn dịch NK (diệt tự nhiên), các tế bào này là một yếu tố quan trọng trong hoạt động chống ung thư [2]. Fucoidan đã được chứng minh gây ra giảm đáng kể số lượng tế bào ung thư phát triển và gây quá trình tự chết (apoptosis) đối với các dòng tế bào ung thư của người như ung thư lympho hạch HS-Sultan cũng như ung thư đại trực tràng các dòng HT-29 và HCT116 một cách phụ thuộc vào liều sử dụng [6] [7].
Fucoidans có thể được chiết xuất và tinh chế từ rong biển thông qua quá trình nhiều bước khác nhau liên quan đến vật lý, hóa học và / hoặc xử lý enzym và các bước phân đoạn và tinh chế khác nhau [8]. Mặc dù các fucoidan được chiết xuất và làm biến đổi khác nhau, đều đã được báo cáo để phát huy hoạt tính sinh học, fucoidan thô đã được tìm thấy để phát huy tác dụng khả năng miễn dịch ở động vật mang khối u, dẫn đến hiệu quả chống khối u [9]. Fucoidan thô (hoặc có chứa fucose-sulfate polysaccharides) có thể được lấy thông qua axit loãng hoặc dung dịch nước chiết xuất bằng cách sử dụng các bước xử lý nhẹ hơn và ít gây biến đổi cấu trúc tối thiểu do đó duy trì các đặc tính tự nhiên của fucoidan. Với kiến thức tốt nhất của chúng tôi, các tác động của fucoidan thô trên các tế bào ung thư phổi và da và các hoạt động phản ứng miễn dịch hiện vẫn chưa được xác định. Vì vậy chúng tôi đã kiểm tra tác động của fucoidan thô được chiết xuất từ Sargassum sp. Và fucus vesiculosus trên sự gia tăng của các tế bào khối u ung thư phổi Lewis và ung thư hắc tố da ác tính B16 và đánh giá ảnh hưởng của nó đối với hoạt động đáp ứng miễn dịch.

Các mục tiêu chủ yếu của công việc hiện tại do đó để xác định xem liệu fucoidan thô có thể ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư da và phổi, và nếu như vậy, để mô tả các nhân tố góp phần đằng sau tác dụng này. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định rằng fucoidan thô gây cản trở tăng trưởng trong ống nghiệm của ung thư phổi Lewis và các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 bằng gây quá trình tự chết của các tế bào ung thư này (apoptosis). Hơn nữa, các hoạt động chống khối u của fucoidan thô dường như được liên kết với một phản ứng miễn dịch, nâng cao, như mô tả bởi sự gia tăng trong hoạt động của tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) ở chuột.

2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Hóa chất
Hai mẫu fucoidan thô được sử dụng thông qua các công việc này. Thứ nhất, fucoidan thô từ Sargassum sp. (MTA) được chiết xuất trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (xem mục 2.2) trong khi fucoidan thô từ F. vesiculosus (SIG) đã thu được thương mại (Công ty Sigma-Aldrich, Steinheim, Đức). Nguyên liệu rong khô Sargassum sp. đã được thu được từ Công ty TNHH Việt Delta (Hồ Chí Minh, Việt Nam). Môi trường nuôi cấy tế bào của hãng MEM- eagle đã được mua từ Công ty Sigma-Aldrich (Steinheim, Đức); huyết thanh thai bò (FBS) là từ các phòng thí nghiệm Flow (North Ryde, NSW, Úc), kháng sinh streptomycin, penicillin và Trypan Blue là từ Gibco (Canada). Hydrochloric acid (37%), d glucose và d-xylose được mua từ Merck (Darmstadt, Đức). Trifluoracetic acid (99%, TFA), axit tricloaxetic (99%, TCA), CaCl2, Na2SO4, BaCl2, arabinose, rhamnose, d-galactose và l-fucose từ Công ty Sigma-Aldrich (Steinheim, Đức). Agarose D-2 thu được từ Hispanagar (Burgos, Tây Ban Nha). Tất cả các hóa chất được sử dụng là thuộc loại phân tích.

2.2.
Chiết xuất fucoidan thô (MTA)
Rong biển chủng loại Sargassum sp. Được giữ lại và rây qua một rây 500 micron. Chiết xuất fucoidan thô đã được thực hiện bằng cách thêm 100 g rong biển đã rây vào bình 5 L có chứa 2 L 0,03 M HCl. Hỗn hợp này sau đó được đặt trong bể ngâm 90° C (Julabo, Đức) với khuấy trộn liên tục ở  200 rpm trong 4 h. Huyền phù rong biển được lọc (giấy lọc Whatman, số 1) để có được một chiết xuất fucoidan. Chiết xuất sau đó được kết tủa bằng cách sử dụng  ethanol (EtOH) 60%, và kết tủa được thu thập sau khi ly tâm (Máy ly tâm phòng thí nghiệm Sigma 4K15, VWR, Đan Mạch) ở 10.600 rpm trong 10 phút và kết quả thu được các viên được sấy đông khô. Viên này là fucoidan thô và được gọi là MTA trong nghiên cứu này. Fucoidan thô (SIG) có nguồn gốc từ F. vesiculosus được thu thương mại từ Sigma-Aldrich Công ty (Steinheim, Đức). Theo mô tả sản phẩm F. vesiculosus fucoidan đã được chuẩn bị thông qua các phương pháp chiết xuất được mô tả bởi Black [10].

2.3. Thủy phân bằng Acid
Bột thô fucoidan đã được sấy đông khô (MTA, 20 mg) và fucoidan thô (SIG, 20 mg) được thu thương mại đã được thủy phân một cách riêng biệt bằng cách sử dụng 2 M TFA (nồng độ cuối cùng) ở 121 ° C trong 2 giờ [11]. Các hỗn hợp thủy phân sau đó được sấy đông khô ở -57 ° C (Heto Lyolab 3000, Anh). Các bột khô được hòa tan lại trong nước cất gấp đôi và ly tâm ở 10.000 rpm trong 10 phút để thu thập các chất nổi trên mặt. Các chất nổi trên mặt đã được lọc qua bộ lọc đầu ống tiêm 0.2 micron (SUN-SRI, Rockwood, TN) trước khi tiêm vào PAD-HPAEC để phân tích monosaccharide (xem mục 2.4).

2.4. Phân tích Fucoidan thành phần
Các chất trên mặt của mỗi mẫu fucoidan thô được axit thủy phân đã được phân tích cho các monosacarit và lượng sulfate. Sự tách biệt và định lượng của monosaccharides được thực hiện bởi HPAEC, PAD phân tích bằng cách sử dụng một hệ thống ICS-3000 bao gồm máy bơm độ dốc (Kiểu DP-1), Máy dò điện hóa / sắc ký tháo rời (kiểu DC-1) và cực góp tự động (Dionex Corp, Sunnyvale, CA). Sự ngăn cách đạt được bằng cách sử dụng một cột CarboPac ™ PA20 (3 mm x 150 mm) phân tích theo phương pháp mô tả bởi Arnous và Meyer [11]. Định lượng dữ liệu được thực hiện bằng cách sử dụng  phần mềm sắc ký  Chromeleon 6,8 SP4 Build 2361 (Dionex Corp, Sunnyvale, CA). Giá trị tìm được của monosaccharides được đánh giá từ sự tồn tại song song, tức là, TFA thủy phân, lượng sấy đông khô, và HPAEC-PAD phân tích, các tiêu chuẩn của monosaccharide như được mô tả trước đây [11]. Phân tích lượng sulfate đã được thực hiện theo phương pháp mô tả bởi Jackson và McCandless [12].

2.5. Nuôi cấy tế bào và khảo nghiệm hoạt động chống khối u
Lewis phổi Ung thư biểu mô (LLC) và các tế bào khối u ác tính hắc tố da B16 (MC) được trồng trong môi trường MEM eagle bổ sung với 10% (v/v) bất hoạt FBS nhiệt, 1% streptomycin-penicillin và 1% của 200 mM l-glutamine. Các tế bào được duy trì ở 37° C dưới 5% CO2. Mỗi phân ước (10 μl) của hỗn hợp tế bào MEM-FBS vừa được pha loãng với 90 μl 0,4% Trypan Blue cho việc đếm tế bào. Sự nuôi cấy sắp từng lớp đơn được thực hiện bằng cách thêm vào 100 μl hỗn hợp tế bào MEM-FBS trên đây trong 96 dãy giếng tấm với mật độ 3 × 104 tế bào. Tấm sau đó được ủ trong 24 giờ trong CO2 5% ở 37° C. Sau đó môi trường đã được gỡ bỏ và thay thế bằng 100 μl môi trường MEM có chứa 2% FBS và nồng độ khác nhau (0,1-1,0 mg/ml) của Sargassum sp. Fucoidan thô (MTA) và fucoidan thô thương mại từ F. vesiculosus (SIG), và sau đó ủ trong 24 giờ. 20 μl dung dịch  MTT (5 mg/ml) đã được thêm vào các tấm nuôi cấy và sau đó chúng được ủ trong 4 giờ. Cuối cùng, 100 μl dung dịch ổn định đã được thêm vào mỗi giếng và các tấm được ủ qua đêm ở 37°C dưới CO2 5%. Kết quả sự hấp thụ được đo bằng cách sử dụng một trình đọc Elisa ở 550-690 nm.

2.6. Khảo nghiệm độ hoạt động tế bào diệt tự nhiên (NK) dựa trên 51Chromium (51Cr) giải phóng ra
Chuột đực C57BL/6J (Clea Nhật Bản Inc., Tokyo, Nhật Bản) được cân trước khi tiêm màng bụng (IP) của mẫu fucoidan (50 mg / kg trọng lượng cơ thể) từ  Sargassum sp. (MTA) và fucoidan thương mại  từ F. vesiculosus (SIG) trong 0,1 ml nước muối sinh lý cho 4 ngày liên tiếp, nước muối sạch được sử dụng kiểm chứng, và Poly I: C được sử dụng xác thực. 3 con chuột được sử dụng mỗi lần nghiên cứu (n = 3). Lá lách chuột đã được gỡ bỏ và đánh trong môi trường huyền phù đầy đủ-1640 RPMI bổ sung với 100 U / ml của penicillin, 100 mg / ml của streptomycin, 2 mM của l-glutamine và 10% FBS. Các tế bào lá lách đã được gieo trong 0,1 ml của môi trường đầy đủ này cho mỗi trong 96 giếng tấm chuẩn (Kiểu -V, Nalge, Nunc, Tokyo, Nhật Bản) ở mật độ của 1 × 107, 0,5 × 106, và 0,25 × 106 tế bào / ml. 51Cr (với natri cromat, 37 MBq / ml, Dupont, NEN Sản phẩm nghiên cứu, DE, USA) đã được sử dụng để đánh dấu cho các tế bào lympho chuột YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK)  bằng cách sử dụng một thời gian phơi sáng 1 giờ sau đó các tế bào đã được rửa sạch, đưa đến một mật độ 1 × 104/ml và được thêm vào  mỗi phân ước 0,1 ml vào các giếng. Tấm được ly tâm trong vòng 3 phút tại 800 rpm và nhiệt độ phòng, và sau đó ủ trong 4 h trong CO2 5% ở 37 ° C. Tỷ lệ phần trăm giải phóng ra cụ thể được tính bằng cách sử dụng công thức: % 51Cr giải phóng ra cụ thể  = [(Giá trị đếm mỗi phút trung bình thử nghiệm giải phóng ra - Giá trị đếm mỗi phút trung bình tự phát) / (Giá trị đếm mỗi phút trung bình tổng cộng có thể giải phóng ra - Giá trị đếm mỗi phút trung bình tự phát)] × 100, dựa trên kết quả từ đo lường phóng xạ nổi trên mặt bằng cách sử dụng một máy đếm – γ (Gamma 5500B, Beckman Instruments Inc, CA, USA). Các thí nghiệm tuân thủ hướng dẫn việc sử dụng các động vật thí nghiệm của các Viện Quốc gia về Y tế  và các quy định về thử nghiệm đã được phê duyệt của Ủy ban Sử dụng động vật của khoa khoa học y tế liên kết, trường Đại học Kitasato trước khi nghiên cứu bắt đầu.

2.7. Khảo nghiệm phát hiện Apoptosis
 
Cả hai MTA và SIG mẫu các fucoidan thô (nồng độ liều 0,8 mg/ml) và một mẫu đối chứng (không có fucoidan) đã được thử nghiệm trên khối u tế bào hắc tố ác tính B16 cho quá trình chết tế bào theo chương trình bởi phương pháp the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end-labeling (TUNEL) sử dụng bộ kit phát hiện apoptosis (Takara Bio Inc, Shiga, Nhật Bản). Các tế bào khối u hác tố ác tính B16 đã được nuôi cấy trong một bản kính mang vật (Lab-Tek Chamber Slides, Nalge Nunc, Tokyo, Japan) mật độ trung bình  5 × 104 tế bào/ml, nghiên cứu với fucoidan cho 48 giờ và sau đó rửa sạch hai lần với PBS theo giải pháp bằng cách sửa chữa của các tế bào bằng cách sử dụng Paraformaldehyde 4%/PBS (pH 7.4). Các tế bào trên các trang trình bày đã được khảo nghiệm theo các giao thức chuẩn được cung cấp trong bộ công cụ phát hiện apoptosis. Các tế bào tự hủy hoại được xem bằng cách sử dụng một kính hiển vi ánh sáng BX51 (Olympus Corp, Tokyo, Nhật Bản).

2.8. Thống kê phân tích
Bảng về dữ liệu và tính toán độ lệch trung bình và tiêu chuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng Excel (Microsoft Office 2010). Phân tích phương sai đã được thực hiện bằng cách sử dụng Minitab 15 (Minitab Inc. State College, PA, USA) bằng cách sử dụng một giá trị ý nghĩa của P ≤ 0,05.

3. Kết quả
3.1. Chiết xuất Fucoidan và phân tích thành phần
Fucoidan MTA thô  chiết xuất từ Sargassum sp. chủ yếu là fucose, acid glucuronic và sulfate (Bảng 1). Số lượng nhỏ các yếu tố monosaccharide hình thành khác như galactose, glucose, xylose, mannose, rhamnose và arabinose cũng được phát hiện (Bảng 1). Fucoidan SIG đã có một mô hình monosaccharide tương tự, nhưng giá trị fucose, galactose, xylose, cao hơn đáng kể trong fucoidan SIG, trong khi axit glucuronic thấp hơn đáng kể so với fucoidan MTA (Bảng 1). Không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy trong nội dung sulfate của MTA và SIG fucoidan (Bảng 1).

Bảng 1. Thành phần Monosaccharide phát hiện bởi HPAEC-PAD từ các mẫu  thủy phân TFA Sargassum sp. fucoidan (MTA), và fucoidan thương mại (SIG) từ F. vesiculosus.

Mẫu

Thành phần Monosaccharide  trong mg/g DW


 

 

Fuc*

Rha

Ara

Gal*

Glc

Xyl*

Man*

GluA*

Sul

MTA

31.4 ± 2.0

1.6 ± 0.1

0.2 ± 0.1

13.9 ±0.8

4.2 ± 0.1

4.2 ± 0.3

5.7 ± 0.5

122.8 ± 7.0

384.4 ± 26.2

SIG

138.7 ± 5.5

2.0 ± 0.6

2.8 ± 0.2

27.9 ± 1.4

2.5 ± 1.8

12.8 ± 1.6

0.2 ± 0.4

18.5 ± 1.9

341.6 ± 45.4

a

Monosaccharide thành phần: Fuc, fucose; RHA, rhamnose, Ara, arabinose, Gal, galactose, GLC, glucose; Xyl, xylose, Man, mannose; GluA, axit glucuronic; Sul, Sulfate.

* Đáng chú ý là khác nhau tại P ≤ 0,05, số lần lặp lại = 4.
Đầy đủ kích thước bảng


3.2. Fucoidan thô ức chế tế bào ung thư da và phổi phát triển trong ống nghiệm
Các tế bào trong ống nghiệm được đánh giá ảnh hưởng của nồng độ khác nhau (0-1,0 mg / ml) fucoidan thô MTA và SIG  trên sự tăng trưởng của tế bào Ung thư biểu mô phổi Lewis (LLC) và u hắc tố da B16 (MC) được thực hiện thông qua đo lường khả năng phát triển tế bào bằng cách sử dụng một khảo nghiệm MTT. Sự tăng trưởng của các tế bào LLC và MC đã bị ảnh hưởng một cách phụ thuộc vào liều lượng bổ sung fucoidan thô MTA và SIG, dựa trên 3 × 104 tế bào trên mật độ tốt sau 24 giờ ủ bệnh (Hình 1a và b). Fucoidan MTA và SIG  thực hiện tương tự và làm giảm số tế bào LLC phát triển trong một dạng phụ thuộc vào liều, với  tế bào có khả năng phát triển giảm đến 40 ± 7% và 36 ± 14% sau khi bổ sung 1,0 mg / ml MTA và SIG, tương ứng (hình 1a). Giảm mạnh mẽ ở số lượng tế bào cũng được ghi nhận cho các tế bào MC, kết quả giảm chỉ còn 56 ± 5% và 50 ± 5% các tế bào có khả năng phát triển khi thêm 0,1 và 0,2 mg / ml fucoidan MTA , tương ứng. Như vậy, giảm sức sống của tế bào gây ra bởi fucoidan MTA là rõ nét hơn đáng kể (P ≤ 0,05) so với giảm tế bào gây ra bởi fucoidan SIG, đặc biệt là ở cấp độ tăng thêm fucoidan thấp (Hình 1b). Ở mức liều 0,4-1,0 mg / ml, khả năng tồn tại tế bào của các tế bào MC đã được giảm xuống còn ~ 10-55% (mức thấp nhất tế bào có thể tồn tại phát triển ở liều lượng fucoidan cao hơn), nhưng không có sự khác biệt đáng kể đã được quan sát trong những tác động của MTA và SIG (Hình 1b). Nó cũng có thể được quan sát từ hình. 1 rằng fucoidan thể hiện hiệu quả hơn trong việc giảm số lượng tế bào sống của MC hơn so với các tế bào LLC một cách phụ thuộc vào liều, với ví dụ như, chỉ có 32 ± 2% tế bào MC có khả năng phát triển (Hình 1b) và 57 ± 7% tế bào LCC có khả năng phát triển  (hình 1a). ở nồng độ fucoidan SIG là 0,6 mg / ml.

Hình 1. Trong ống nghiệm, phân tích các hoạt động trực tiếp vào các tế bào ung thư phổi và u hắc tố da ác tính của fucoidan thô có nguồn gốc từ Sargassum sp. (MTA) và fucoidan thương mại (SIG) có nguồn gốc từ F. vesiculosus. (A) Fucoidan hoạt động trên tế bào Ung thư biểu mô phổi Lewis, và (b) hoạt động fucoidan trên các tế bào u hắc tố da B16. Trên đây mật độ tế bào là 3 × 104 tế bào. Dữ liệu được hiển thị như là giá trị trung bình ± s.d. Mức ý nghĩa P ≤ 0,05, n = 4.

Xem hình ảnh thu nhỏ
3.3. Fucoidan t gây ra apoptosis của các tế bào hắc tố da B16
Để có thể xác định xem liệu fucoidan thô do giảm tế bào có khả năng tồn tại và phát triển đã được khởi động apoptosis, phương pháp TUNEL sử dụng các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 và 3,3 Diaminobenzidine chất nền (DAB) với việc đếm nhuộm màu sử dụng 1% methylgreen. Đánh giá của apoptosis do hai loại fucoidan đã được chỉ được thực hiện trên các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16  bởi vì các tế bào này thể hiện là đặc biệt nhạy cảm với fucoidan MTA và cho thấy một phản ứng tăng trưởng khác biệt giữa hai loại fucoidan thô (Hình 1). Việc nghiên cứu các tế bào hắc tố B16 với 0,8 mg / ml MTA và SIG fucoidan kết quả phân mảnh và co lại của chất nhiễm sắc, hình dung như một màu nâu sẫm bên trong nhân tế bào, đặc biệt rõ ràng cho fucoidan MTA nghiên cứu tế bào (Hình 2) . (Đối với giải thích của các tài liệu tham khảo màu sắc trong văn bản này, người đọc được gọi phiên bản web của bài viết.)

Hình 2. Hình ảnh của tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 sau khi tiếp xúc với fucoidan: u hắc tố B16 tế bào nuôi trên các bản kính ở mật độ 5 × 104 tế bào / ml, và ủ trong 48 h trong trường hợp không (CONT) và có sự hiện diện của fucoidan thô ( MTA, SIG) cho biết liều 0,8 mg / ml. Chất nền DAB đã được sử dụng và các hình ảnh được chụp ảnh bằng cách sử dụng một kính hiển vi Olympus BX51 sau hai thí nghiệm độc lập.

Xem hình ảnh thu nhỏ
3.4.  Hoạt hóa hoạt động của tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) gây ra bởi fucoidan thô
Trọng lượng của các chuột đực C57BL/6J (Clea Nhật Bản Inc., Tokyo, Nhật Bản) đã được ghi lại và sự tỉnh táo vốn có của những con chuột đã được quan sát thấy hàng ngày trong 4 ngày. Các hồ sơ cho thấy không có khác biệt đáng kể về trọng lượng, và rằng tất cả các con chuột vận động cơ thể không có dấu hiệu cho thấy khác biệt trong toàn bộ thời gian thí nghiệm (dữ liệu không hiển thị). Fucoidan MTA và SIG  gây ra tăng lên đáng kể mức độ hoạt động của tế bào NK ở lách những con chuột C57BL/6J, đánh giá là độ giải phóng cụ thể sau khi tiêm màng bụng hàng ngày mẫu fucoidan trong bốn ngày liên tiếp (Hình 3). Tế bào NK hoạt động tại 100:1 tác động đến tỷ lệ mục tiêu tăng đáng kể ở những con chuột được nghiên cứu  bằng fucoidan đến 14 ± 3,8% cho MTA và 11 ± 1.7% của SIG so với 5,1 ± 2,1% trong việc đối chứng ở những con chuột không được điều trị (Hình 3) . Việc xác thực tích cực Poly I: C, % giải phóng cụ thể tại 100:1 là 26 ± 9%. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các tác động của MTA và SIG đã được phát hiện ở tất cả các tác động để nhắm mục tiêu tỷ lệ với fucoidan MTA hoạt hoá hoạt động NK hơn SIG fucoidan, và những ảnh hưởng của cả hai fucoidans đáng kể (P ≤ 0,05) tốt hơn so với đối chứng (Hình 3 ).


Hình 3. Tế bào diệt tự nhiên (NK) kích hoạt trong các tế bào lá lách của chuột C57BL/6J (n = 3) có đánh dấu phóng xạ 51Cr lên tế bào đích YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK) được tiêm màng bụng 4 ngày với một trong hai nước muối hoặc fucoidan (50 mg / kg). Khả năng gây độc đã được xác định bằng cách đo 51Cr giải phóng ra vào lúc 4 giờ thể hiện như phần trăm giảm dần cụ thể. Tích cực đối chứng  Poly I: C cụ thể % giải phóng ra tại 100:1 là 26,2 ± 8,9%. (E) / (T); tác động / mục tiêu. Dữ liệu được hiển thị như là giá trị trung bình ± s.d.

Xem hình ảnh thu nhỏ
4. Thảo luận
Nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ung thư trên toàn thế giới là ung thư phổi và tỷ lệ mắc u hắc tố da ác tính đã tăng lên đáng kể trong vài thập kỷ qua [13]. Hiện các chiến lược điều trị để chống lại các bệnh ung thư chỉ cung cấp những lợi ích tối thiểu và đưa đến với bệnh nhân ung thư các rủi ro đáng kể, các tác dụng phụ không mong muốn và các biến chứng. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc sử dụng các hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ sinh vật có nguồn gốc tự nhiên dựa trên tiềm năng của chúng như là các tác nhân dự phòng ung thư. Fucoidan là một polysaccharide sulfate mạch dài thu được từ tự nhiên ở rong biển ăn được màu nâu. Trong nhiều năm, những loài cỏ biển đã là một phần của chế độ ăn châu Á. Một nghiên cứu tiến hành trên toàn dân số Nhật Bản điều tra tác động lớn của chế độ ăn uống trên bệnh mãn tính cho thấy việc tiêu thụ rong biển có liên quan với tỷ lệ tử vong thấp hơn từ tất cả các nguyên nhân, bao gồm ung thư phổi ở những người đàn ông và phụ nữ [14]. Mô hình thí nghiệm trên động vật đã cho thấy tác dụng chống ung thư trực tiếp sau kết hợp của rong biển màu nâu của loại Undaria và Laminaria vào chế độ ăn, động vật không có dấu hiệu giảm cân hoặc tăng / hoặc thay đổi trong trọng lượng của bộ phận cơ thể, có nghĩa là không có ảnh hưởng trực tiếp gây chết người. Mặc dù các thành phần hoạt động trong những loài cỏ biển đã không được xác định, nó thường được thừa nhận rằng những tác động có thể do fucoidan [15] [16]. Như vậy, tiềm năng của fucoidan như một tác nhân xuất sắc để phòng ngừa hoặc kiểm soát ung thư phổi và ung thư da được xem là đầy hứa hẹn cung cấp cho nó thực sự phát huy hiệu quả ngăn chặn, phòng ngừa ung thư.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các fucoidan thô chiết xuất từ Sargassum sp. trên sàng thông qua một bước duy nhất chiết xuất sử dụng 0,03 M HCl ở 90 ° C cho 4 h, và fucoidan thô thương mại thu được  từ F. vesiculosus. Chúng tôi ghi nhận rằng thành phần hóa học của các loài rong biển đặc sắc khác nhau. Đặc biệt, các nội dung +fucose, galactose và acid glucuronic là khác nhau khá nhiều, trong khi không có sự khác biệt lưu ý trong nội dung sulfate (Bảng 1). Mức độ liều lượng thấp của fucoidan MTA gây ra giảm đáng kể sự gia tăng của tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 hơn fucoidan SIG, nhưng nói chung các xét nghiệm tế bào phổ biến cho thấy hiệu ứng họat tính sinh học gần như tương tự của fucoidan MTA và SIG với tế bào ung thư phổi Lewis và tế bào u hắc tố da B16 (Hình 1). Những dữ liệu này chỉ ra rằng họat tính sinh học fucoidan thô đối với các dòng tế bào có thể liên quan đến các nhóm sulfate hiện diện trong cấu trúc fucoidan hơn là sự hiện diện của một lượng đáng kể fucose. Các quan sát tương tự đã được báo cáo của Yamamoto et al. [17] đối với ảnh hưởng của hàm lượng fucose của fucoidan trên sự ức chế tăng trưởng của các tế bào Bướu thịt-180; Yamamoto et al. [17] từ đó đã phát hiện ra rằng sulfat hơn là hàm lượng fucose của fucoidan thô gây ra những hoạt động chống khối u.

Hàm lượng sulfate của fucoidan MTA và SIG là 38,4% và 34,2%, tương ứng (Bảng 1). Những kết quả này đồng nhất với các tác giả Koyanagi et al. [18] đã báo cáo rằng tinh khiết fucoidan từ F. vesiculosus có chứa sulfat 32,6% là hoạt chất chống angiogenic (tạo mạch khối U) mạnh và rằng oversulfation fucoidan có thể đã tăng cường các hoạt động chống hình thành mạch và chống khối u của fucoidan. Ngoài ra, các hoạt động chống đông máu của polysaccharides sulfate đã được báo cáo có liên quan đến mức độ sulfat [19]. Ngược lại, Cumashi et al. [20] nghiên cứu chín fucoidans khác nhau, cả đã tinh chế và thấy rằng không phải nội dung của fucose, sulfate, cũng không phải đặc điểm cấu trúc khác của mạch polysaccharide gây ảnh hưởng đáng kể hiệu quả của hoạt động sinh học của fucoidan. Những kết luận mâu thuẫn về các hoạt động sinh học của fucoidan đã mở đường cho thăm dò tiếp theo của chủ đề này. Trong khi nghiên cứu hiện nay là quá sớm để làm sáng tỏ mối quan hệ giữa các thành phần của fucoidan thô và các hoạt động sinh học của nó, nó đã chỉ ra rằng fucoidan thô tác động đáng kể tác dụng chống tăng sinh trên cả hai loại các tế bào ung thư phổi và da.

Trong quá khứ, hầu hết các nghiên cứu chống ung thư của fucoidan đã sử dụng loại tinh khiết, và cho thấy tác dụng ức chế liên quan đến di căn [20], sự hình thành mạch [18] và ức chế sự tăng trưởng trong một loạt các tế bào ung thư [21] và [22]. Tuy nhiên, khả năng của fucoidan thô để ức chế tế bào ung thư cũng đã được ghi nhận trước đây dựa trên các nghiên cứu khác nhau trong in vivo và nghiên cứu in vitro, bao gồm cả sự ức chế tăng trưởng của tế bào bướu thịt sarcoma -180 cấy ghép  dưới da chuột thực nghiệm [17] và gây ra apoptosis HCT-15 tế bào ung thư đại tràng [23] . Tuy nhiên, kiến thức của chúng ta về các tác động của fucoidan thô trên phổi và ung thư da là hạn chế, do đó, nghiên cứu chi tiết phải được thực hiện để làm sáng tỏ các cơ chế cơ bản đằng sau các hiệu ứng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng fucoidan thô ức chế hiệu quả tế bào ung thư phổi Lewis và u hắc tố da B16 ở nồng độ từ 0,1 đến 1,0 mg / ml (Hình 1). Chúng tôi cũng kiểm tra xem sự ức chế khối u quan sát từ fucoidan thô là do hoạt động chống khối u hoặc khả năng gây độc trực tiếp. Nhìn chung, trong hoạt động gây độc tế bào in vitro của fucoidan chống lại tế bào ung thư phổi Lewis và u hắc tố da B16 tăng trong một kiểu phụ thuộc vào liều lượng (Hình 1). Như vậy, nó có thể kết luận rằng fucoidan thô thể hiện một tác dụng yếu, trực tiếp gây độc tế bào chống lại các tế bào gây ung thư này. Hơn nữa, sự vắng mặt của việc giảm cân và bạc nhược ở những con chuột được tiêm màng bụng với fucoidan MTA và SIG (dữ liệu không hiển thị) cho thấy sự ức chế sự tăng trưởng tế bào của LLC và MC là do, ít nhất là một phần, hoạt động chống khối u của nó.

Fucoidan thô và một số chất chiết xuất từ rong biển có hoạt động miễn dịch, chẳng hạn như tăng cường hoạt động của tế bào NK các hoạt động chống khối u [9] và [24]. Các tế bào NK xuất hiện để đại diện cho một dòng đầu tiên của hệ thống phòng thủ chống lại sự lây lan của các tế bào máu gây ra di căn khối u. Hoạt động của các tế bào NK bình thường cũng là nhân tố quan trọng trong việc giám sát miễn dịch chống lại khối u [25]. Chúng tôi nghiên cứu hoạt động của tế bào NK trong sự hiện diện và vắng mặt của fucoidan thô MTA và SIG trong chuột đực C57BL/6J. Các kích hoạt xác định được của các tế bào NK chống lại các tế bào mục tiêu YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK) đã được cải thiện đáng kể trong các con chuột sau 4 ngày của tiêm màng bụng với fucoidan thô (Hình 3). Fucoidan thô do đó tác dụng chống khối u hoạt động thông qua sự tăng cường của các phản ứng miễn dịch. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng fucoidan từ Undaria pinnatifida tăng cường đáp ứng miễn dịch và các hoạt động như là một immunopotentiator trong các con chuột mang khối u, dẫn đến hiệu quả chống khối u [16]. Các tế bào miễn dịch NK tham gia sản xuất một số các cytokine, chẳng hạn như interferon-γ (IFN-γ), sản phẩm trực tiếp bởi các tế bào miễn dịch T được kích thích bởi interleukin-12 (IL-12) [26]. Nó đã được báo cáo rằng sự kích thích IL-12 một mình sản xuất chỉ tăng thêm trung bình của khả năng gây độc tế bào NK. Tuy nhiên, IL-12 khi cùng tổng hợp sức mạnh với interleukin-2 (IL-2) sẽ làm tăng hoạt tính xúc tác của tế bào lympho chống lại mục tiêu tự thân [27]. Do đó, kích thích với IL-2 và IL-12 thúc đẩy sự tăng tiết của IFN-γ, cơ chế đằng sau fucoidan tăng cường kích hoạt tế bào NK có thể là tương tự (Hình 3).

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng fucoidan gây ra apoptosis trong tế bào ung thư đại tràng của con người HT-29 [7], các tế bào ung thư vú MCF-7 [28], và tế bào ung thư hạch của con người HS-Sultan [6]. Trong nghiên cứu này, fucoidan thô tác dụng hoạt động thông qua ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi Lewis và tế bào u hắc tố B16. Như vậy, chúng tôi đã nghiên cứu liệu fucoidan thô có tác dụng hoạt động gây apoptosis. Việc nhuộm tế bào với các chất nền DAB cho thấy thay đổi hình thái học của các tế bào khối u ác tính B16, như được chỉ ra bởi một màu sắc cường độ cao màu nâu sẫm bên trong nhân tế bào (Hình 2). Một sự thay đổi hình thái riêng biệt của các tế bào tự hủy diệt, bao gồm sửa đổi, bổ sung các the Cytoskeleton mà kết quả trong vỡ màng tế bào, co nhiễm sắc thể và sự gãy đứt của ADN [26]. Trong nghiên cứu hiện tại, fucoidan thô đã được hiển thị để tạo ra apoptosis, báo cáo trước đó đã gợi ý rằng fucoidan gây ra apoptosis qua sự kích hoạt của caspase-3 trong nhân tế bào HS-Sultan [6], thông qua con đường phụ thuộc caspase-8 trong tế bào MCF-7 [28] và thông qua kích hoạt các caspases qua cả cái chết qua trung gian thụ thể và con đường tự hủy hoại ty thể qua trung gian [7]. Các cơ chế chi tiết của lộ trình kích hoạt rõ ràng xứng đáng điều tra thêm.

5. Kết luận
Chúng tôi đã xem xét các hoạt tính sinh học của fucoidan thô thông qua đánh giá hiệu quả của nó trong kiểm soát hoặc ức chế tế bào ung thư phổi và tế bào ung thư hắc tố da phổ biến trong ống nghiệm. Hoạt tính sinh học của fucoidan thô đối với hai loại dòng tế bào có thể được tạo ra bởi các nhóm sulfate trong cấu trúc fucoidan. Những phát hiện này cần được nghiên cứu hơn nữa để làm sáng tỏ các yếu tố cơ bản của hoạt tính sinh học fucoidan. Nghiên cứu cho thấy rằng fucoidan thô gây ra apoptosis của các tế bào ung thư phổi Lewis và tế bào ung thư hắc tố da B16 và hoạt động chống khối u thông qua ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư phổi Lewis và tế bào ung thư hắc tố da B16. Trong thực tế nghiên cứu, các tế bào miễn dịch NK của những con chuột được điều trị với fucoidan thô đã hoạt động như những nhân tố trung gian chính giết chết tế bào khối u. Nhìn chung, hoạt động chống khối u thúc đẩy bởi fucoidan thô được dựa trên việc tăng cường các hoạt động của tế bào miễn dịch NK. Fucoidan thô từ Sargassum sp. và F. vesiculosus do đó thể hiện là một hoạt chất chống ung thư phổi mạnh, phòng ngừa ung thư da và cơ chế hoạt động của nó có liên quan với các phản ứng miễn dịch.

Lời cảm ơn
Các tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn của mình đến của Kitasato H. Tiến sĩ và Tiến sĩ K. Ishihara - Khoa Khoa học Y tế liên kết, Đại học Kitasato - Sagamihara, Kanagawa, Nhật Bản với sự hỗ trợ không mệt mỏi của họ, hỗ trợ và khuyến khích; và chia sẻ cơ sở phòng thí nghiệm của họ trong toàn bộ công việc thử nghiệm.

Tài liệu tham khảo

[1] T.V. Alekseyenko, S.Y. Zhanayeva, A.A. Venediktova, T.N. Zvyagintseva, T.A. Kuznetsova, N.N. Besednova, T.A. Korolenko Bull. Exp. Biol. Med, 143 (2007), trang 730-732

[2] H. Maruyama, Tamauchi H., M. Iizuka, T. Nakano Planta Med, 72 (2006), trang 1415-1417

[3] I.D. Makarenkova, P.G. Deriabin, D.K. L'Đài Tiếng nói Việt Nam, T.N. Zviagintseva, N.N. Besednova Vopr. Virusol, 55 (2010), trang 41-45

4] Z. Zhu, Zhang Q., L. Chen, S. Ren, P. Xu, Y. Tang, D. Luo Thromb. Res, 125 (2010), trang 419-426

[5] M.A. Rahman, A.R. Amin, D.M. Shin Nutr. Cancer 62 (2010), trang 973-987

[6] Y. Asia, Y. Miyakawa, T. Nakazato, H. Shibata, K. Saito, Y. Ikeda, M. Kizaki Là. J. Hematol, 78 (2005), trang 7-14

[7] E.J. Kim, S.Y. Park, J.Y. Lee, J.H. Park BMC Gastroenterol, 10 (2010), p. 96

[8] A.D Holtkamp, S. Kelly R. Ulber, S. Lang Appl. Microbiol. Biotechnol, 82 (2009), trang 1-11

[9] M. Takahashi J. Jpn. Sóc. Reticuloendothel. Syst, 22 (1983), trang 269-283

[10] W.A.P. Black, E.T. Dewar, F.N. Woodward J. Sci. Thực phẩm Agric, 3 (1952), trang 122-129

[11] A. Arnous, A. Meyer Food Bioprod. Process, 86 (2008), trang 79-86
[12] S.G. Jackson, E.L. McCandless Anal. Biochem, 90 (1978), trang 802-808
[13] L. Garibyan, D.E. Fisher Curr. Curr. ONCOL. Rep. 12 (2010), trang 319-326

[14] H. Iso, Y. Kubota Asian Pac. J. Cancer Prec. 8 (2007), trang 35-80

[15] J. Teas, M.L. Harbison, R.S. Gelman Cancer Res. (1984), trang 2758-2761

[16] H. Maruyama, Tamauchi H., M. Hashimoto, T. Nakano Vivo, 17 (2003), trang 245-249

[17] I. Yamamoto, Takahashi M., T. Suzuki, H. Seino, H. Mori Jpn. J. Exp. Med, 54 (1984), trang 143-151

[18] S. Koyanagi, N. Tanigawa, H. Nakagawa, S. Soeda, H. Shimeno Biochem. Pharmacol, 65 (2003), trang 173-179

[19] L. Chevolot, A. Foucault, F. Chaubet, Kervarec N., C. Sinquin, Fisher, C. Boisson-Vidal Carbohydr. Res, 319 (1999), trang 154-165

[20] A. Cumashi, NA Ushakova, ME Preobrazhenskaya, A. D'Incecco, A. Piccoli, L. Totani, N. Tinari, GE Morozevich, A.E. Berman, M.I. Bilan, A.I. Usov, N.E. Ustyuzhanina, A.A. Grachev, C.J. Sanderson, M. Kelly, G.A. Rabinovich, S. Iacobelli, N.E. Nifantiev Glycobiology, 17 (2007), trang 541-552

[21] N.Y Lee, S.P. Ermakova, T.N. Zvyagintseva, K.W. Kang, Z. Dong, H.S. Choi Food Chem. Toxicol, 46. (2008), trang 1793-1800

[22] T. Teruya, T. Konishi, S. Uechi, H. Tamaki, M. Tako Int. J. Biol. Macromol, 41. (2007), trang 221-226

[23] J.H. Hyun, Kim S.C., J.I. Kang, M.K. Kim, H.J. Boo, J.M. Kwon, Y.S. Koh, J.W. Hyun, D.B. Park, E.S. Yoo, H.K. Kang Biol. Pharm. Bull, 32 (2009), trang 1760-1764

[24] B.E. Shan, Y. Yoshida, E. Kuroda, U. Yamashita Int. J. Immunopharmacol, 21 (1999), trang 59-70

[25] T.L. Whiteside, R.B. Herberman Clin. Immunol. Immunopathol., 53 (1989), trang. 1–23 

[26] T.J. Kindt, R.A. Goldsby, B.A. Osborne W.H. Freeman and Company (Ed.), Cell-Mediated Cytotoxic Responses,Kuby Immunology,New York(2007), trang. 360–363 

27] C.L. Nastala, H.D. Edington, T.G. McKinney, H. Tahara, M.A. Nalesnik, M.J. Brunda, M.K. Gately, S.F. Wolf, R.D. Schreiber, W.J. Storkus, M.T. Lotza J. Immunol., 151 (1994), trang. 1697–1706 

[28] Y. Yamasaki-Miyamoto, M. Yamasaki, H. Tachibana, K. Yamada J. Agric. Food Chem., 57 (2009), trang. 8677–8682

 

 

#

INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES 49 (2011) 331-336

 

Fucoidan chiết xuất từ Sargassum sp. và fucus vesiculosus làm giảm khả năng tồn tại của các tế bào ung thư phổi và các tế bào ung thư hắc tố da ác tính trong ống nghiệm và kích hoạt các tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) trên cơ thể của chuột thực nghiệm


Marcel Tutor Ale (a), Hiroko Maruyama (b), Hidekazu Tamauchi (c), Jorn D. Mikkelsen (a), Anne S. Meyer (a),
(a) Trung tâm Xử Lý Sinh Học, Hóa chất và Kỹ thuật Hóa sinh, Đại học Kỹ thuật Đan Mạch (DTU), tòa nhà Soltofts Plads 229, 2800 Kgs. Lyngby, Đan Mạch
(b) Chuyên ngành Bệnh học, Khoa liên kết Khoa học, Đại học Kitasato, Kitasato 1-15-1, Sagamihara, Kanagawa 228-8555, Nhật Bản
(c) Chuyên ngành Vi sinh vật, Khoa Y, Đại học Kitasato, Kitasato 1-15-1, Sagamihara, Kanagawa 228-8555, Nhật Bản
Ngày 06 tháng 3 năm 2011. Sửa đổi 21 tháng Tư 2011. Chấp nhận 14 May 2011. Có sẵn trực tuyến ngày 23 tháng 5 năm 2011.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2011.05.009
-------------------------------------------------- ------------------------------

Tóm tắt

Fucoidan được biết đến với các hoạt động sinh học rất quan trọng, bao gồm cả hoạt động chống khối u. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra ảnh hưởng của fucoidan thô được chiết xuất từ Sargassum sp. (MTA) và fucus vesiculosus (SIG) trên các tế bào ung thư phổi Lewis (LCC) và các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 (MC). Trong vitro, các nghiên cứu được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích khả năng tồn tại của tế bào và cho thấy fucoidan SIG và MTA làm giảm đáng kể số lượng của các tế bào LCC và MC phát triển ở liều đáp ứng. Sự nhuộm các chất hóa học cho thấy được những sự thay đổi hình thái của các tế bào u hắc tố da B16 sau khi tiếp xúc với fucoidan. Những thay đổi quan sát được thể hiện fucoidan thô gây ra quá trình apoptosis. Chuột đực C57BL/6JJCL đã bị tiêm màng bụng hàng ngày, hơn 4 ngày với một trong hai loại fucoidan SIG hoặc MTA (liều 50 mg / kg trọng lượng cơ thể). Mức độ hoạt hóa các tế bào diệt tự nhiên (NK) được tăng cường bởi fucoidan thô một cách phụ thuộc vào liều dùng theo sự hiển thị bởi chất đồng vị phóng xạ [51Cr ] được đánh dấu lên tế bào đích lympho chuột YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK) giải phóng ra.

Nghiên cứu này cung cấp sự thể hiện rõ rằng fucoidan thô tác động hiệu ứng hoạt tính sinh học vào mô hình tế bào ung thư phổi và da trong ống nghiệm và gây ra sự tăng cường kích hoạt các tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) trên cơ thể chuột thí nghiệm.

1. Giới thiệu
Fucoidan là một thuật ngữ được sử dụng cho một nhóm polysaccharides giàu sulfate fucose có chứa một lượng khác nhau của galactose, xylose và acid glucuronic. Fucoidan có thể được chiết xuất từ rong biển màu nâu như Sargassum sp. và fucus sp. Gần đây, chức năng sinh học đa dạng của fucoidan đã được nghiên cứu chuyên sâu, các chức năng sinh học thường được cho của fucoidan bao gồm kháng u và điều hòa miễn dịch [1] và [2], chống virus [3], tác dụng chống huyết khối và chống đông máu [4]. Việc sử dụng các hợp chất tự nhiên hoạt tính sinh học cho ngăn chặn, phòng ngừa ung thư phát triển mạnh và đã được công nhận là một lĩnh vực tiềm năng rất lớn [5]. Fucoidan chiết xuất từ rong biển màu nâu đã được báo cáo để tăng cường hoạt động của tế bào miễn dịch NK (diệt tự nhiên), các tế bào này là một yếu tố quan trọng trong hoạt động chống ung thư [2]. Fucoidan đã được chứng minh gây ra giảm đáng kể số lượng tế bào ung thư phát triển và gây quá trình tự chết (apoptosis) đối với các dòng tế bào ung thư của người như ung thư lympho hạch HS-Sultan cũng như ung thư đại trực tràng các dòng HT-29 và HCT116 một cách phụ thuộc vào liều sử dụng [6] [7].
Fucoidans có thể được chiết xuất và tinh chế từ rong biển thông qua quá trình nhiều bước khác nhau liên quan đến vật lý, hóa học và / hoặc xử lý enzym và các bước phân đoạn và tinh chế khác nhau [8]. Mặc dù các fucoidan được chiết xuất và làm biến đổi khác nhau, đều đã được báo cáo để phát huy hoạt tính sinh học, fucoidan thô đã được tìm thấy để phát huy tác dụng khả năng miễn dịch ở động vật mang khối u, dẫn đến hiệu quả chống khối u [9]. Fucoidan thô (hoặc có chứa fucose-sulfate polysaccharides) có thể được lấy thông qua axit loãng hoặc dung dịch nước chiết xuất bằng cách sử dụng các bước xử lý nhẹ hơn và ít gây biến đổi cấu trúc tối thiểu do đó duy trì các đặc tính tự nhiên của fucoidan. Với kiến thức tốt nhất của chúng tôi, các tác động của fucoidan thô trên các tế bào ung thư phổi và da và các hoạt động phản ứng miễn dịch hiện vẫn chưa được xác định. Vì vậy chúng tôi đã kiểm tra tác động của fucoidan thô được chiết xuất từ Sargassum sp. Và fucus vesiculosus trên sự gia tăng của các tế bào khối u ung thư phổi Lewis và ung thư hắc tố da ác tính B16 và đánh giá ảnh hưởng của nó đối với hoạt động đáp ứng miễn dịch.

Các mục tiêu chủ yếu của công việc hiện tại do đó để xác định xem liệu fucoidan thô có thể ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư da và phổi, và nếu như vậy, để mô tả các nhân tố góp phần đằng sau tác dụng này. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định rằng fucoidan thô gây cản trở tăng trưởng trong ống nghiệm của ung thư phổi Lewis và các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 bằng gây quá trình tự chết của các tế bào ung thư này (apoptosis). Hơn nữa, các hoạt động chống khối u của fucoidan thô dường như được liên kết với một phản ứng miễn dịch, nâng cao, như mô tả bởi sự gia tăng trong hoạt động của tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) ở chuột.

2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Hóa chất
Hai mẫu fucoidan thô được sử dụng thông qua các công việc này. Thứ nhất, fucoidan thô từ Sargassum sp. (MTA) được chiết xuất trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (xem mục 2.2) trong khi fucoidan thô từ F. vesiculosus (SIG) đã thu được thương mại (Công ty Sigma-Aldrich, Steinheim, Đức). Nguyên liệu rong khô Sargassum sp. đã được thu được từ Công ty TNHH Việt Delta (Hồ Chí Minh, Việt Nam). Môi trường nuôi cấy tế bào của hãng MEM- eagle đã được mua từ Công ty Sigma-Aldrich (Steinheim, Đức); huyết thanh thai bò (FBS) là từ các phòng thí nghiệm Flow (North Ryde, NSW, Úc), kháng sinh streptomycin, penicillin và Trypan Blue là từ Gibco (Canada). Hydrochloric acid (37%), d glucose và d-xylose được mua từ Merck (Darmstadt, Đức). Trifluoracetic acid (99%, TFA), axit tricloaxetic (99%, TCA), CaCl2, Na2SO4, BaCl2, arabinose, rhamnose, d-galactose và l-fucose từ Công ty Sigma-Aldrich (Steinheim, Đức). Agarose D-2 thu được từ Hispanagar (Burgos, Tây Ban Nha). Tất cả các hóa chất được sử dụng là thuộc loại phân tích.

2.2.
Chiết xuất fucoidan thô (MTA)
Rong biển chủng loại Sargassum sp. Được giữ lại và rây qua một rây 500 micron. Chiết xuất fucoidan thô đã được thực hiện bằng cách thêm 100 g rong biển đã rây vào bình 5 L có chứa 2 L 0,03 M HCl. Hỗn hợp này sau đó được đặt trong bể ngâm 90° C (Julabo, Đức) với khuấy trộn liên tục ở  200 rpm trong 4 h. Huyền phù rong biển được lọc (giấy lọc Whatman, số 1) để có được một chiết xuất fucoidan. Chiết xuất sau đó được kết tủa bằng cách sử dụng  ethanol (EtOH) 60%, và kết tủa được thu thập sau khi ly tâm (Máy ly tâm phòng thí nghiệm Sigma 4K15, VWR, Đan Mạch) ở 10.600 rpm trong 10 phút và kết quả thu được các viên được sấy đông khô. Viên này là fucoidan thô và được gọi là MTA trong nghiên cứu này. Fucoidan thô (SIG) có nguồn gốc từ F. vesiculosus được thu thương mại từ Sigma-Aldrich Công ty (Steinheim, Đức). Theo mô tả sản phẩm F. vesiculosus fucoidan đã được chuẩn bị thông qua các phương pháp chiết xuất được mô tả bởi Black [10].

2.3. Thủy phân bằng Acid
Bột thô fucoidan đã được sấy đông khô (MTA, 20 mg) và fucoidan thô (SIG, 20 mg) được thu thương mại đã được thủy phân một cách riêng biệt bằng cách sử dụng 2 M TFA (nồng độ cuối cùng) ở 121 ° C trong 2 giờ [11]. Các hỗn hợp thủy phân sau đó được sấy đông khô ở -57 ° C (Heto Lyolab 3000, Anh). Các bột khô được hòa tan lại trong nước cất gấp đôi và ly tâm ở 10.000 rpm trong 10 phút để thu thập các chất nổi trên mặt. Các chất nổi trên mặt đã được lọc qua bộ lọc đầu ống tiêm 0.2 micron (SUN-SRI, Rockwood, TN) trước khi tiêm vào PAD-HPAEC để phân tích monosaccharide (xem mục 2.4).

2.4. Phân tích Fucoidan thành phần
Các chất trên mặt của mỗi mẫu fucoidan thô được axit thủy phân đã được phân tích cho các monosacarit và lượng sulfate. Sự tách biệt và định lượng của monosaccharides được thực hiện bởi HPAEC, PAD phân tích bằng cách sử dụng một hệ thống ICS-3000 bao gồm máy bơm độ dốc (Kiểu DP-1), Máy dò điện hóa / sắc ký tháo rời (kiểu DC-1) và cực góp tự động (Dionex Corp, Sunnyvale, CA). Sự ngăn cách đạt được bằng cách sử dụng một cột CarboPac ™ PA20 (3 mm x 150 mm) phân tích theo phương pháp mô tả bởi Arnous và Meyer [11]. Định lượng dữ liệu được thực hiện bằng cách sử dụng  phần mềm sắc ký  Chromeleon 6,8 SP4 Build 2361 (Dionex Corp, Sunnyvale, CA). Giá trị tìm được của monosaccharides được đánh giá từ sự tồn tại song song, tức là, TFA thủy phân, lượng sấy đông khô, và HPAEC-PAD phân tích, các tiêu chuẩn của monosaccharide như được mô tả trước đây [11]. Phân tích lượng sulfate đã được thực hiện theo phương pháp mô tả bởi Jackson và McCandless [12].

2.5. Nuôi cấy tế bào và khảo nghiệm hoạt động chống khối u
Lewis phổi Ung thư biểu mô (LLC) và các tế bào khối u ác tính hắc tố da B16 (MC) được trồng trong môi trường MEM eagle bổ sung với 10% (v/v) bất hoạt FBS nhiệt, 1% streptomycin-penicillin và 1% của 200 mM l-glutamine. Các tế bào được duy trì ở 37° C dưới 5% CO2. Mỗi phân ước (10 μl) của hỗn hợp tế bào MEM-FBS vừa được pha loãng với 90 μl 0,4% Trypan Blue cho việc đếm tế bào. Sự nuôi cấy sắp từng lớp đơn được thực hiện bằng cách thêm vào 100 μl hỗn hợp tế bào MEM-FBS trên đây trong 96 dãy giếng tấm với mật độ 3 × 104 tế bào. Tấm sau đó được ủ trong 24 giờ trong CO2 5% ở 37° C. Sau đó môi trường đã được gỡ bỏ và thay thế bằng 100 μl môi trường MEM có chứa 2% FBS và nồng độ khác nhau (0,1-1,0 mg/ml) của Sargassum sp. Fucoidan thô (MTA) và fucoidan thô thương mại từ F. vesiculosus (SIG), và sau đó ủ trong 24 giờ. 20 μl dung dịch  MTT (5 mg/ml) đã được thêm vào các tấm nuôi cấy và sau đó chúng được ủ trong 4 giờ. Cuối cùng, 100 μl dung dịch ổn định đã được thêm vào mỗi giếng và các tấm được ủ qua đêm ở 37°C dưới CO2 5%. Kết quả sự hấp thụ được đo bằng cách sử dụng một trình đọc Elisa ở 550-690 nm.

2.6. Khảo nghiệm độ hoạt động tế bào diệt tự nhiên (NK) dựa trên 51Chromium (51Cr) giải phóng ra
Chuột đực C57BL/6J (Clea Nhật Bản Inc., Tokyo, Nhật Bản) được cân trước khi tiêm màng bụng (IP) của mẫu fucoidan (50 mg / kg trọng lượng cơ thể) từ  Sargassum sp. (MTA) và fucoidan thương mại  từ F. vesiculosus (SIG) trong 0,1 ml nước muối sinh lý cho 4 ngày liên tiếp, nước muối sạch được sử dụng kiểm chứng, và Poly I: C được sử dụng xác thực. 3 con chuột được sử dụng mỗi lần nghiên cứu (n = 3). Lá lách chuột đã được gỡ bỏ và đánh trong môi trường huyền phù đầy đủ-1640 RPMI bổ sung với 100 U / ml của penicillin, 100 mg / ml của streptomycin, 2 mM của l-glutamine và 10% FBS. Các tế bào lá lách đã được gieo trong 0,1 ml của môi trường đầy đủ này cho mỗi trong 96 giếng tấm chuẩn (Kiểu -V, Nalge, Nunc, Tokyo, Nhật Bản) ở mật độ của 1 × 107, 0,5 × 106, và 0,25 × 106 tế bào / ml. 51Cr (với natri cromat, 37 MBq / ml, Dupont, NEN Sản phẩm nghiên cứu, DE, USA) đã được sử dụng để đánh dấu cho các tế bào lympho chuột YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK)  bằng cách sử dụng một thời gian phơi sáng 1 giờ sau đó các tế bào đã được rửa sạch, đưa đến một mật độ 1 × 104/ml và được thêm vào  mỗi phân ước 0,1 ml vào các giếng. Tấm được ly tâm trong vòng 3 phút tại 800 rpm và nhiệt độ phòng, và sau đó ủ trong 4 h trong CO2 5% ở 37 ° C. Tỷ lệ phần trăm giải phóng ra cụ thể được tính bằng cách sử dụng công thức: % 51Cr giải phóng ra cụ thể  = [(Giá trị đếm mỗi phút trung bình thử nghiệm giải phóng ra - Giá trị đếm mỗi phút trung bình tự phát) / (Giá trị đếm mỗi phút trung bình tổng cộng có thể giải phóng ra - Giá trị đếm mỗi phút trung bình tự phát)] × 100, dựa trên kết quả từ đo lường phóng xạ nổi trên mặt bằng cách sử dụng một máy đếm – γ (Gamma 5500B, Beckman Instruments Inc, CA, USA). Các thí nghiệm tuân thủ hướng dẫn việc sử dụng các động vật thí nghiệm của các Viện Quốc gia về Y tế  và các quy định về thử nghiệm đã được phê duyệt của Ủy ban Sử dụng động vật của khoa khoa học y tế liên kết, trường Đại học Kitasato trước khi nghiên cứu bắt đầu.

2.7. Khảo nghiệm phát hiện Apoptosis
 
Cả hai MTA và SIG mẫu các fucoidan thô (nồng độ liều 0,8 mg/ml) và một mẫu đối chứng (không có fucoidan) đã được thử nghiệm trên khối u tế bào hắc tố ác tính B16 cho quá trình chết tế bào theo chương trình bởi phương pháp the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end-labeling (TUNEL) sử dụng bộ kit phát hiện apoptosis (Takara Bio Inc, Shiga, Nhật Bản). Các tế bào khối u hác tố ác tính B16 đã được nuôi cấy trong một bản kính mang vật (Lab-Tek Chamber Slides, Nalge Nunc, Tokyo, Japan) mật độ trung bình  5 × 104 tế bào/ml, nghiên cứu với fucoidan cho 48 giờ và sau đó rửa sạch hai lần với PBS theo giải pháp bằng cách sửa chữa của các tế bào bằng cách sử dụng Paraformaldehyde 4%/PBS (pH 7.4). Các tế bào trên các trang trình bày đã được khảo nghiệm theo các giao thức chuẩn được cung cấp trong bộ công cụ phát hiện apoptosis. Các tế bào tự hủy hoại được xem bằng cách sử dụng một kính hiển vi ánh sáng BX51 (Olympus Corp, Tokyo, Nhật Bản).

2.8. Thống kê phân tích
Bảng về dữ liệu và tính toán độ lệch trung bình và tiêu chuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng Excel (Microsoft Office 2010). Phân tích phương sai đã được thực hiện bằng cách sử dụng Minitab 15 (Minitab Inc. State College, PA, USA) bằng cách sử dụng một giá trị ý nghĩa của P ≤ 0,05.

3. Kết quả
3.1. Chiết xuất Fucoidan và phân tích thành phần
Fucoidan MTA thô  chiết xuất từ Sargassum sp. chủ yếu là fucose, acid glucuronic và sulfate (Bảng 1). Số lượng nhỏ các yếu tố monosaccharide hình thành khác như galactose, glucose, xylose, mannose, rhamnose và arabinose cũng được phát hiện (Bảng 1). Fucoidan SIG đã có một mô hình monosaccharide tương tự, nhưng giá trị fucose, galactose, xylose, cao hơn đáng kể trong fucoidan SIG, trong khi axit glucuronic thấp hơn đáng kể so với fucoidan MTA (Bảng 1). Không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy trong nội dung sulfate của MTA và SIG fucoidan (Bảng 1).

Bảng 1. Thành phần Monosaccharide phát hiện bởi HPAEC-PAD từ các mẫu  thủy phân TFA Sargassum sp. fucoidan (MTA), và fucoidan thương mại (SIG) từ F. vesiculosus.

Mẫu

Thành phần Monosaccharide  trong mg/g DW


 

 

Fuc*

Rha

Ara

Gal*

Glc

Xyl*

Man*

GluA*

Sul

MTA

31.4 ± 2.0

1.6 ± 0.1

0.2 ± 0.1

13.9 ±0.8

4.2 ± 0.1

4.2 ± 0.3

5.7 ± 0.5

122.8 ± 7.0

384.4 ± 26.2

SIG

138.7 ± 5.5

2.0 ± 0.6

2.8 ± 0.2

27.9 ± 1.4

2.5 ± 1.8

12.8 ± 1.6

0.2 ± 0.4

18.5 ± 1.9

341.6 ± 45.4

a

Monosaccharide thành phần: Fuc, fucose; RHA, rhamnose, Ara, arabinose, Gal, galactose, GLC, glucose; Xyl, xylose, Man, mannose; GluA, axit glucuronic; Sul, Sulfate.

* Đáng chú ý là khác nhau tại P ≤ 0,05, số lần lặp lại = 4.
Đầy đủ kích thước bảng


3.2. Fucoidan thô ức chế tế bào ung thư da và phổi phát triển trong ống nghiệm
Các tế bào trong ống nghiệm được đánh giá ảnh hưởng của nồng độ khác nhau (0-1,0 mg / ml) fucoidan thô MTA và SIG  trên sự tăng trưởng của tế bào Ung thư biểu mô phổi Lewis (LLC) và u hắc tố da B16 (MC) được thực hiện thông qua đo lường khả năng phát triển tế bào bằng cách sử dụng một khảo nghiệm MTT. Sự tăng trưởng của các tế bào LLC và MC đã bị ảnh hưởng một cách phụ thuộc vào liều lượng bổ sung fucoidan thô MTA và SIG, dựa trên 3 × 104 tế bào trên mật độ tốt sau 24 giờ ủ bệnh (Hình 1a và b). Fucoidan MTA và SIG  thực hiện tương tự và làm giảm số tế bào LLC phát triển trong một dạng phụ thuộc vào liều, với  tế bào có khả năng phát triển giảm đến 40 ± 7% và 36 ± 14% sau khi bổ sung 1,0 mg / ml MTA và SIG, tương ứng (hình 1a). Giảm mạnh mẽ ở số lượng tế bào cũng được ghi nhận cho các tế bào MC, kết quả giảm chỉ còn 56 ± 5% và 50 ± 5% các tế bào có khả năng phát triển khi thêm 0,1 và 0,2 mg / ml fucoidan MTA , tương ứng. Như vậy, giảm sức sống của tế bào gây ra bởi fucoidan MTA là rõ nét hơn đáng kể (P ≤ 0,05) so với giảm tế bào gây ra bởi fucoidan SIG, đặc biệt là ở cấp độ tăng thêm fucoidan thấp (Hình 1b). Ở mức liều 0,4-1,0 mg / ml, khả năng tồn tại tế bào của các tế bào MC đã được giảm xuống còn ~ 10-55% (mức thấp nhất tế bào có thể tồn tại phát triển ở liều lượng fucoidan cao hơn), nhưng không có sự khác biệt đáng kể đã được quan sát trong những tác động của MTA và SIG (Hình 1b). Nó cũng có thể được quan sát từ hình. 1 rằng fucoidan thể hiện hiệu quả hơn trong việc giảm số lượng tế bào sống của MC hơn so với các tế bào LLC một cách phụ thuộc vào liều, với ví dụ như, chỉ có 32 ± 2% tế bào MC có khả năng phát triển (Hình 1b) và 57 ± 7% tế bào LCC có khả năng phát triển  (hình 1a). ở nồng độ fucoidan SIG là 0,6 mg / ml.

Hình 1. Trong ống nghiệm, phân tích các hoạt động trực tiếp vào các tế bào ung thư phổi và u hắc tố da ác tính của fucoidan thô có nguồn gốc từ Sargassum sp. (MTA) và fucoidan thương mại (SIG) có nguồn gốc từ F. vesiculosus. (A) Fucoidan hoạt động trên tế bào Ung thư biểu mô phổi Lewis, và (b) hoạt động fucoidan trên các tế bào u hắc tố da B16. Trên đây mật độ tế bào là 3 × 104 tế bào. Dữ liệu được hiển thị như là giá trị trung bình ± s.d. Mức ý nghĩa P ≤ 0,05, n = 4.

Xem hình ảnh thu nhỏ
3.3. Fucoidan t gây ra apoptosis của các tế bào hắc tố da B16
Để có thể xác định xem liệu fucoidan thô do giảm tế bào có khả năng tồn tại và phát triển đã được khởi động apoptosis, phương pháp TUNEL sử dụng các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 và 3,3 Diaminobenzidine chất nền (DAB) với việc đếm nhuộm màu sử dụng 1% methylgreen. Đánh giá của apoptosis do hai loại fucoidan đã được chỉ được thực hiện trên các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16  bởi vì các tế bào này thể hiện là đặc biệt nhạy cảm với fucoidan MTA và cho thấy một phản ứng tăng trưởng khác biệt giữa hai loại fucoidan thô (Hình 1). Việc nghiên cứu các tế bào hắc tố B16 với 0,8 mg / ml MTA và SIG fucoidan kết quả phân mảnh và co lại của chất nhiễm sắc, hình dung như một màu nâu sẫm bên trong nhân tế bào, đặc biệt rõ ràng cho fucoidan MTA nghiên cứu tế bào (Hình 2) . (Đối với giải thích của các tài liệu tham khảo màu sắc trong văn bản này, người đọc được gọi phiên bản web của bài viết.)

Hình 2. Hình ảnh của tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 sau khi tiếp xúc với fucoidan: u hắc tố B16 tế bào nuôi trên các bản kính ở mật độ 5 × 104 tế bào / ml, và ủ trong 48 h trong trường hợp không (CONT) và có sự hiện diện của fucoidan thô ( MTA, SIG) cho biết liều 0,8 mg / ml. Chất nền DAB đã được sử dụng và các hình ảnh được chụp ảnh bằng cách sử dụng một kính hiển vi Olympus BX51 sau hai thí nghiệm độc lập.

Xem hình ảnh thu nhỏ
3.4.  Hoạt hóa hoạt động của tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) gây ra bởi fucoidan thô
Trọng lượng của các chuột đực C57BL/6J (Clea Nhật Bản Inc., Tokyo, Nhật Bản) đã được ghi lại và sự tỉnh táo vốn có của những con chuột đã được quan sát thấy hàng ngày trong 4 ngày. Các hồ sơ cho thấy không có khác biệt đáng kể về trọng lượng, và rằng tất cả các con chuột vận động cơ thể không có dấu hiệu cho thấy khác biệt trong toàn bộ thời gian thí nghiệm (dữ liệu không hiển thị). Fucoidan MTA và SIG  gây ra tăng lên đáng kể mức độ hoạt động của tế bào NK ở lách những con chuột C57BL/6J, đánh giá là độ giải phóng cụ thể sau khi tiêm màng bụng hàng ngày mẫu fucoidan trong bốn ngày liên tiếp (Hình 3). Tế bào NK hoạt động tại 100:1 tác động đến tỷ lệ mục tiêu tăng đáng kể ở những con chuột được nghiên cứu  bằng fucoidan đến 14 ± 3,8% cho MTA và 11 ± 1.7% của SIG so với 5,1 ± 2,1% trong việc đối chứng ở những con chuột không được điều trị (Hình 3) . Việc xác thực tích cực Poly I: C, % giải phóng cụ thể tại 100:1 là 26 ± 9%. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các tác động của MTA và SIG đã được phát hiện ở tất cả các tác động để nhắm mục tiêu tỷ lệ với fucoidan MTA hoạt hoá hoạt động NK hơn SIG fucoidan, và những ảnh hưởng của cả hai fucoidans đáng kể (P ≤ 0,05) tốt hơn so với đối chứng (Hình 3 ).


Hình 3. Tế bào diệt tự nhiên (NK) kích hoạt trong các tế bào lá lách của chuột C57BL/6J (n = 3) có đánh dấu phóng xạ 51Cr lên tế bào đích YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK) được tiêm màng bụng 4 ngày với một trong hai nước muối hoặc fucoidan (50 mg / kg). Khả năng gây độc đã được xác định bằng cách đo 51Cr giải phóng ra vào lúc 4 giờ thể hiện như phần trăm giảm dần cụ thể. Tích cực đối chứng  Poly I: C cụ thể % giải phóng ra tại 100:1 là 26,2 ± 8,9%. (E) / (T); tác động / mục tiêu. Dữ liệu được hiển thị như là giá trị trung bình ± s.d.

Xem hình ảnh thu nhỏ
4. Thảo luận
Nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ung thư trên toàn thế giới là ung thư phổi và tỷ lệ mắc u hắc tố da ác tính đã tăng lên đáng kể trong vài thập kỷ qua [13]. Hiện các chiến lược điều trị để chống lại các bệnh ung thư chỉ cung cấp những lợi ích tối thiểu và đưa đến với bệnh nhân ung thư các rủi ro đáng kể, các tác dụng phụ không mong muốn và các biến chứng. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc sử dụng các hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ sinh vật có nguồn gốc tự nhiên dựa trên tiềm năng của chúng như là các tác nhân dự phòng ung thư. Fucoidan là một polysaccharide sulfate mạch dài thu được từ tự nhiên ở rong biển ăn được màu nâu. Trong nhiều năm, những loài cỏ biển đã là một phần của chế độ ăn châu Á. Một nghiên cứu tiến hành trên toàn dân số Nhật Bản điều tra tác động lớn của chế độ ăn uống trên bệnh mãn tính cho thấy việc tiêu thụ rong biển có liên quan với tỷ lệ tử vong thấp hơn từ tất cả các nguyên nhân, bao gồm ung thư phổi ở những người đàn ông và phụ nữ [14]. Mô hình thí nghiệm trên động vật đã cho thấy tác dụng chống ung thư trực tiếp sau kết hợp của rong biển màu nâu của loại Undaria và Laminaria vào chế độ ăn, động vật không có dấu hiệu giảm cân hoặc tăng / hoặc thay đổi trong trọng lượng của bộ phận cơ thể, có nghĩa là không có ảnh hưởng trực tiếp gây chết người. Mặc dù các thành phần hoạt động trong những loài cỏ biển đã không được xác định, nó thường được thừa nhận rằng những tác động có thể do fucoidan [15] [16]. Như vậy, tiềm năng của fucoidan như một tác nhân xuất sắc để phòng ngừa hoặc kiểm soát ung thư phổi và ung thư da được xem là đầy hứa hẹn cung cấp cho nó thực sự phát huy hiệu quả ngăn chặn, phòng ngừa ung thư.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các fucoidan thô chiết xuất từ Sargassum sp. trên sàng thông qua một bước duy nhất chiết xuất sử dụng 0,03 M HCl ở 90 ° C cho 4 h, và fucoidan thô thương mại thu được  từ F. vesiculosus. Chúng tôi ghi nhận rằng thành phần hóa học của các loài rong biển đặc sắc khác nhau. Đặc biệt, các nội dung +fucose, galactose và acid glucuronic là khác nhau khá nhiều, trong khi không có sự khác biệt lưu ý trong nội dung sulfate (Bảng 1). Mức độ liều lượng thấp của fucoidan MTA gây ra giảm đáng kể sự gia tăng của tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 hơn fucoidan SIG, nhưng nói chung các xét nghiệm tế bào phổ biến cho thấy hiệu ứng họat tính sinh học gần như tương tự của fucoidan MTA và SIG với tế bào ung thư phổi Lewis và tế bào u hắc tố da B16 (Hình 1). Những dữ liệu này chỉ ra rằng họat tính sinh học fucoidan thô đối với các dòng tế bào có thể liên quan đến các nhóm sulfate hiện diện trong cấu trúc fucoidan hơn là sự hiện diện của một lượng đáng kể fucose. Các quan sát tương tự đã được báo cáo của Yamamoto et al. [17] đối với ảnh hưởng của hàm lượng fucose của fucoidan trên sự ức chế tăng trưởng của các tế bào Bướu thịt-180; Yamamoto et al. [17] từ đó đã phát hiện ra rằng sulfat hơn là hàm lượng fucose của fucoidan thô gây ra những hoạt động chống khối u.

Hàm lượng sulfate của fucoidan MTA và SIG là 38,4% và 34,2%, tương ứng (Bảng 1). Những kết quả này đồng nhất với các tác giả Koyanagi et al. [18] đã báo cáo rằng tinh khiết fucoidan từ F. vesiculosus có chứa sulfat 32,6% là hoạt chất chống angiogenic (tạo mạch khối U) mạnh và rằng oversulfation fucoidan có thể đã tăng cường các hoạt động chống hình thành mạch và chống khối u của fucoidan. Ngoài ra, các hoạt động chống đông máu của polysaccharides sulfate đã được báo cáo có liên quan đến mức độ sulfat [19]. Ngược lại, Cumashi et al. [20] nghiên cứu chín fucoidans khác nhau, cả đã tinh chế và thấy rằng không phải nội dung của fucose, sulfate, cũng không phải đặc điểm cấu trúc khác của mạch polysaccharide gây ảnh hưởng đáng kể hiệu quả của hoạt động sinh học của fucoidan. Những kết luận mâu thuẫn về các hoạt động sinh học của fucoidan đã mở đường cho thăm dò tiếp theo của chủ đề này. Trong khi nghiên cứu hiện nay là quá sớm để làm sáng tỏ mối quan hệ giữa các thành phần của fucoidan thô và các hoạt động sinh học của nó, nó đã chỉ ra rằng fucoidan thô tác động đáng kể tác dụng chống tăng sinh trên cả hai loại các tế bào ung thư phổi và da.

Trong quá khứ, hầu hết các nghiên cứu chống ung thư của fucoidan đã sử dụng loại tinh khiết, và cho thấy tác dụng ức chế liên quan đến di căn [20], sự hình thành mạch [18] và ức chế sự tăng trưởng trong một loạt các tế bào ung thư [21] và [22]. Tuy nhiên, khả năng của fucoidan thô để ức chế tế bào ung thư cũng đã được ghi nhận trước đây dựa trên các nghiên cứu khác nhau trong in vivo và nghiên cứu in vitro, bao gồm cả sự ức chế tăng trưởng của tế bào bướu thịt sarcoma -180 cấy ghép  dưới da chuột thực nghiệm [17] và gây ra apoptosis HCT-15 tế bào ung thư đại tràng [23] . Tuy nhiên, kiến thức của chúng ta về các tác động của fucoidan thô trên phổi và ung thư da là hạn chế, do đó, nghiên cứu chi tiết phải được thực hiện để làm sáng tỏ các cơ chế cơ bản đằng sau các hiệu ứng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng fucoidan thô ức chế hiệu quả tế bào ung thư phổi Lewis và u hắc tố da B16 ở nồng độ từ 0,1 đến 1,0 mg / ml (Hình 1). Chúng tôi cũng kiểm tra xem sự ức chế khối u quan sát từ fucoidan thô là do hoạt động chống khối u hoặc khả năng gây độc trực tiếp. Nhìn chung, trong hoạt động gây độc tế bào in vitro của fucoidan chống lại tế bào ung thư phổi Lewis và u hắc tố da B16 tăng trong một kiểu phụ thuộc vào liều lượng (Hình 1). Như vậy, nó có thể kết luận rằng fucoidan thô thể hiện một tác dụng yếu, trực tiếp gây độc tế bào chống lại các tế bào gây ung thư này. Hơn nữa, sự vắng mặt của việc giảm cân và bạc nhược ở những con chuột được tiêm màng bụng với fucoidan MTA và SIG (dữ liệu không hiển thị) cho thấy sự ức chế sự tăng trưởng tế bào của LLC và MC là do, ít nhất là một phần, hoạt động chống khối u của nó.

Fucoidan thô và một số chất chiết xuất từ rong biển có hoạt động miễn dịch, chẳng hạn như tăng cường hoạt động của tế bào NK các hoạt động chống khối u [9] và [24]. Các tế bào NK xuất hiện để đại diện cho một dòng đầu tiên của hệ thống phòng thủ chống lại sự lây lan của các tế bào máu gây ra di căn khối u. Hoạt động của các tế bào NK bình thường cũng là nhân tố quan trọng trong việc giám sát miễn dịch chống lại khối u [25]. Chúng tôi nghiên cứu hoạt động của tế bào NK trong sự hiện diện và vắng mặt của fucoidan thô MTA và SIG trong chuột đực C57BL/6J. Các kích hoạt xác định được của các tế bào NK chống lại các tế bào mục tiêu YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK) đã được cải thiện đáng kể trong các con chuột sau 4 ngày của tiêm màng bụng với fucoidan thô (Hình 3). Fucoidan thô do đó tác dụng chống khối u hoạt động thông qua sự tăng cường của các phản ứng miễn dịch. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng fucoidan từ Undaria pinnatifida tăng cường đáp ứng miễn dịch và các hoạt động như là một immunopotentiator trong các con chuột mang khối u, dẫn đến hiệu quả chống khối u [16]. Các tế bào miễn dịch NK tham gia sản xuất một số các cytokine, chẳng hạn như interferon-γ (IFN-γ), sản phẩm trực tiếp bởi các tế bào miễn dịch T được kích thích bởi interleukin-12 (IL-12) [26]. Nó đã được báo cáo rằng sự kích thích IL-12 một mình sản xuất chỉ tăng thêm trung bình của khả năng gây độc tế bào NK. Tuy nhiên, IL-12 khi cùng tổng hợp sức mạnh với interleukin-2 (IL-2) sẽ làm tăng hoạt tính xúc tác của tế bào lympho chống lại mục tiêu tự thân [27]. Do đó, kích thích với IL-2 và IL-12 thúc đẩy sự tăng tiết của IFN-γ, cơ chế đằng sau fucoidan tăng cường kích hoạt tế bào NK có thể là tương tự (Hình 3).

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng fucoidan gây ra apoptosis trong tế bào ung thư đại tràng của con người HT-29 [7], các tế bào ung thư vú MCF-7 [28], và tế bào ung thư hạch của con người HS-Sultan [6]. Trong nghiên cứu này, fucoidan thô tác dụng hoạt động thông qua ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi Lewis và tế bào u hắc tố B16. Như vậy, chúng tôi đã nghiên cứu liệu fucoidan thô có tác dụng hoạt động gây apoptosis. Việc nhuộm tế bào với các chất nền DAB cho thấy thay đổi hình thái học của các tế bào khối u ác tính B16, như được chỉ ra bởi một màu sắc cường độ cao màu nâu sẫm bên trong nhân tế bào (Hình 2). Một sự thay đổi hình thái riêng biệt của các tế bào tự hủy diệt, bao gồm sửa đổi, bổ sung các the Cytoskeleton mà kết quả trong vỡ màng tế bào, co nhiễm sắc thể và sự gãy đứt của ADN [26]. Trong nghiên cứu hiện tại, fucoidan thô đã được hiển thị để tạo ra apoptosis, báo cáo trước đó đã gợi ý rằng fucoidan gây ra apoptosis qua sự kích hoạt của caspase-3 trong nhân tế bào HS-Sultan [6], thông qua con đường phụ thuộc caspase-8 trong tế bào MCF-7 [28] và thông qua kích hoạt các caspases qua cả cái chết qua trung gian thụ thể và con đường tự hủy hoại ty thể qua trung gian [7]. Các cơ chế chi tiết của lộ trình kích hoạt rõ ràng xứng đáng điều tra thêm.

5. Kết luận
Chúng tôi đã xem xét các hoạt tính sinh học của fucoidan thô thông qua đánh giá hiệu quả của nó trong kiểm soát hoặc ức chế tế bào ung thư phổi và tế bào ung thư hắc tố da phổ biến trong ống nghiệm. Hoạt tính sinh học của fucoidan thô đối với hai loại dòng tế bào có thể được tạo ra bởi các nhóm sulfate trong cấu trúc fucoidan. Những phát hiện này cần được nghiên cứu hơn nữa để làm sáng tỏ các yếu tố cơ bản của hoạt tính sinh học fucoidan. Nghiên cứu cho thấy rằng fucoidan thô gây ra apoptosis của các tế bào ung thư phổi Lewis và tế bào ung thư hắc tố da B16 và hoạt động chống khối u thông qua ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư phổi Lewis và tế bào ung thư hắc tố da B16. Trong thực tế nghiên cứu, các tế bào miễn dịch NK của những con chuột được điều trị với fucoidan thô đã hoạt động như những nhân tố trung gian chính giết chết tế bào khối u. Nhìn chung, hoạt động chống khối u thúc đẩy bởi fucoidan thô được dựa trên việc tăng cường các hoạt động của tế bào miễn dịch NK. Fucoidan thô từ Sargassum sp. và F. vesiculosus do đó thể hiện là một hoạt chất chống ung thư phổi mạnh, phòng ngừa ung thư da và cơ chế hoạt động của nó có liên quan với các phản ứng miễn dịch.

Lời cảm ơn
Các tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn của mình đến của Kitasato H. Tiến sĩ và Tiến sĩ K. Ishihara - Khoa Khoa học Y tế liên kết, Đại học Kitasato - Sagamihara, Kanagawa, Nhật Bản với sự hỗ trợ không mệt mỏi của họ, hỗ trợ và khuyến khích; và chia sẻ cơ sở phòng thí nghiệm của họ trong toàn bộ công việc thử nghiệm.

Tài liệu tham khảo

[1] T.V. Alekseyenko, S.Y. Zhanayeva, A.A. Venediktova, T.N. Zvyagintseva, T.A. Kuznetsova, N.N. Besednova, T.A. Korolenko Bull. Exp. Biol. Med, 143 (2007), trang 730-732

[2] H. Maruyama, Tamauchi H., M. Iizuka, T. Nakano Planta Med, 72 (2006), trang 1415-1417

[3] I.D. Makarenkova, P.G. Deriabin, D.K. L'Đài Tiếng nói Việt Nam, T.N. Zviagintseva, N.N. Besednova Vopr. Virusol, 55 (2010), trang 41-45

4] Z. Zhu, Zhang Q., L. Chen, S. Ren, P. Xu, Y. Tang, D. Luo Thromb. Res, 125 (2010), trang 419-426

[5] M.A. Rahman, A.R. Amin, D.M. Shin Nutr. Cancer 62 (2010), trang 973-987

[6] Y. Asia, Y. Miyakawa, T. Nakazato, H. Shibata, K. Saito, Y. Ikeda, M. Kizaki Là. J. Hematol, 78 (2005), trang 7-14

[7] E.J. Kim, S.Y. Park, J.Y. Lee, J.H. Park BMC Gastroenterol, 10 (2010), p. 96

[8] A.D Holtkamp, S. Kelly R. Ulber, S. Lang Appl. Microbiol. Biotechnol, 82 (2009), trang 1-11

[9] M. Takahashi J. Jpn. Sóc. Reticuloendothel. Syst, 22 (1983), trang 269-283

[10] W.A.P. Black, E.T. Dewar, F.N. Woodward J. Sci. Thực phẩm Agric, 3 (1952), trang 122-129

[11] A. Arnous, A. Meyer Food Bioprod. Process, 86 (2008), trang 79-86
[12] S.G. Jackson, E.L. McCandless Anal. Biochem, 90 (1978), trang 802-808
[13] L. Garibyan, D.E. Fisher Curr. Curr. ONCOL. Rep. 12 (2010), trang 319-326

[14] H. Iso, Y. Kubota Asian Pac. J. Cancer Prec. 8 (2007), trang 35-80

[15] J. Teas, M.L. Harbison, R.S. Gelman Cancer Res. (1984), trang 2758-2761

[16] H. Maruyama, Tamauchi H., M. Hashimoto, T. Nakano Vivo, 17 (2003), trang 245-249

[17] I. Yamamoto, Takahashi M., T. Suzuki, H. Seino, H. Mori Jpn. J. Exp. Med, 54 (1984), trang 143-151

[18] S. Koyanagi, N. Tanigawa, H. Nakagawa, S. Soeda, H. Shimeno Biochem. Pharmacol, 65 (2003), trang 173-179

[19] L. Chevolot, A. Foucault, F. Chaubet, Kervarec N., C. Sinquin, Fisher, C. Boisson-Vidal Carbohydr. Res, 319 (1999), trang 154-165

[20] A. Cumashi, NA Ushakova, ME Preobrazhenskaya, A. D'Incecco, A. Piccoli, L. Totani, N. Tinari, GE Morozevich, A.E. Berman, M.I. Bilan, A.I. Usov, N.E. Ustyuzhanina, A.A. Grachev, C.J. Sanderson, M. Kelly, G.A. Rabinovich, S. Iacobelli, N.E. Nifantiev Glycobiology, 17 (2007), trang 541-552

[21] N.Y Lee, S.P. Ermakova, T.N. Zvyagintseva, K.W. Kang, Z. Dong, H.S. Choi Food Chem. Toxicol, 46. (2008), trang 1793-1800

[22] T. Teruya, T. Konishi, S. Uechi, H. Tamaki, M. Tako Int. J. Biol. Macromol, 41. (2007), trang 221-226

[23] J.H. Hyun, Kim S.C., J.I. Kang, M.K. Kim, H.J. Boo, J.M. Kwon, Y.S. Koh, J.W. Hyun, D.B. Park, E.S. Yoo, H.K. Kang Biol. Pharm. Bull, 32 (2009), trang 1760-1764

[24] B.E. Shan, Y. Yoshida, E. Kuroda, U. Yamashita Int. J. Immunopharmacol, 21 (1999), trang 59-70

[25] T.L. Whiteside, R.B. Herberman Clin. Immunol. Immunopathol., 53 (1989), trang. 1–23 

[26] T.J. Kindt, R.A. Goldsby, B.A. Osborne W.H. Freeman and Company (Ed.), Cell-Mediated Cytotoxic Responses,Kuby Immunology,New York(2007), trang. 360–363 

27] C.L. Nastala, H.D. Edington, T.G. McKinney, H. Tahara, M.A. Nalesnik, M.J. Brunda, M.K. Gately, S.F. Wolf, R.D. Schreiber, W.J. Storkus, M.T. Lotza J. Immunol., 151 (1994), trang. 1697–1706 

[28] Y. Yamasaki-Miyamoto, M. Yamasaki, H. Tachibana, K. Yamada J. Agric. Food Chem., 57 (2009), trang. 8677–8682